探究鲎试剂检测法变异性与测试误差的根源

一、介绍

鲎试剂‍（LAL）测定法是药典中用于检查药品（如USP <85>章所述）、加工材料和药用级水中细菌内毒素的检测方法。

对于任何生物测试，测试结果都容易受到分析条件变化的影响。在这里，鲎试剂测定法即使作为生物测定法，也具有相对较高的变异性^[1]。这种变化主要来自3个方面：试剂、产品和方法^[2]。本文以光度法（显色法和比浊法）为重点，探讨了造成鲎试剂检测差异的一些原因，并研究了如何通过良好的实验室质量控制来评估差异。

二、鲎试剂测试的变异性

鲎试剂检测的不同方面都会造成差异。这些方面包括鲎试剂、内毒素对照标准、标准曲线和稀释误差。我们将依次对这些方面进行研究。

（一）鲎试剂

鲎试剂会导致检测结果的差异，原因如下：

鲎试剂（鲎溶解物）来源于生物，是多种酶和辅助因子的复杂混合物。该提取物是相对粗糙的混合物，不是单一的纯化酶，这意味着无法准确测定每批裂解物的酶活性。

生产过程中会添加缓冲剂和洗涤剂，这也是造成差异的一个原因。

制造商使用美国药典提供的参考标准内毒素（RSE）对每批鲎试剂的酶活性进行评估，通过进行2倍稀释系列来评估鲎试剂的灵敏度。用于表征裂解液的RSE因其稀有性和昂贵性，并非所有检测实验室都能轻易获得，所以实验室通常使用细菌内毒素工作标准品（CSE）。CSE的效力由鲎试剂供应商根据RSE评估CSE来确定。这就增加了测试差异的可能性。

（二）细菌内毒素

检测中使用的内毒素会导致差异，这是因为：

实验室中用于制备细菌内毒素工作标准品（CSE）的内毒素来自纯化的大肠杆菌菌株。CSE是一种高度纯化的脂多糖，不含大多数可检测的污染物（如蛋白质）。CSE含有额外的稳定填充剂，如淀粉、人血清白蛋白和聚乙二醇。然而，环境内毒素未经纯化，通常以脂多糖、细胞膜蛋白和磷脂的大分子复合物的形式存在，这些物质由革兰氏阴性细菌在生长和死亡过程中脱落。因此，根据纯化内毒素标准测定环境内毒素时存在差异^[3]。

此外，尽管鲎试剂检测对内毒素具有特异性，但它只能检测内毒素分子中可用于激活裂解物的脂质A部分（凝血级联反应的激活，因子C通路，如下所述）[4]。内毒素分子的脂质A部分可能形成未完全分散的聚集体，因此不够均匀，无法进行准确的总测量。

因此，检测到内毒素的样品不一定能显示出样品中的所有内毒素，因为这取决于脂质A的含量，所以检测到内毒素的样品可能会被低估。此外，检测到内毒素的样本在重复检测时可能不会显示出相同水平的内毒素，因为随着时间的推移，样本的化学性质和稳定性会发生变化，脂质A的可用性也会随之改变。还应注意的是，不同类型的环境内毒素的毒性和反应性有所不同，这取决于脂质A分子对不同细菌种类的生物活性。

（三）鲎试剂检测法的变异性

鲎试剂检测法固有的变异性为50%至200%（或每个内毒素标准两侧各有一个2倍误差）。对于动力学测定法，变异性源于内毒素标准曲线的斜率^[5]。

检测变化可能来自一系列测试输入，包括：

●试管

●一次性移液器吸头

●微量移液器吸头

针对上述情况，BET测试中使用的塑料（例如微量滴定板、塑料稀释管）通常不是专门为内毒素检测而制造的。

●无菌技术

●分析技术

●移液方法的差异

●制备控制标准品的差异

●稀释液配制过程中的变化（如果错误发生在系列中的第一个稀释中，则差异会放大）

长期储存的稀释液会发生变化。可变因素包括温度、容器成分、稀释范围和稀释体积）。

●交叉污染

●产品或样品干扰

●取样容器

●样品储存时间和温度

●LAL仪器/模块变化——不同的仪器可能会产生不同的结果

●产品中存在内毒素（内毒素分子表现不同或脂质A的可用性不同）

●添加缓冲液以稳定pH值

辅助溶液可能不含内毒素。

上述某些问题与检测技术人员的操作直接相关（如稀释液的配制、移液、原材料的称重和无菌技术等）。

（四）内毒素浓度

随着标准系列使用的内毒素浓度变小，误差的显著性也会增加。例如，标准曲线为1.0至0.1 EU/mL时，50%至200%的误差将比5.0至0.005 EU/mL的标准系列产生的影响较小，这是因为标准系列中最后一个内毒素浓度值较小。也许正是由于这些原因，药典中列出的测试对照品的可接受加标回收率为50%至200%。

（五）稀释误差

测试稀释时可能会出现错误，特别是在稀释内毒素和绘制标准曲线时。为避免在绘制标准曲线时出现稀释误差，建议采取以下控制措施：

每批内毒素或裂解物在常规使用前，应由3名技术人员对稀释系列进行鉴定，每次对稀释系列进行3次验证。每个接受过该试验培训的新技术人员都要进行类似的操作。

对于常规检测，不同试验的稀释顺序不应有差异（即，始终进行相同类型的稀释）。

内毒素的起始浓度应始终保持相同（通常为1000EU/mL）。内毒素标准曲线是根据相同的内毒素起始浓度（1000EU/mL）绘制的。这一点可通过查看生产商的分析证书进行验证，也可通过比较使用中的对照标准内毒素和参考标准内毒素（均为大肠杆菌O113:H10的纯化提取物）对生产商的证书进行确认测试。

尽管如此，在上述情况下，如果进行测试的技术人员出了差错，仍有可能发生稀释错误。

（六）标准曲线线性关系

标准曲线的一致性是鲎试剂检测的一个重要特征。线性标准曲线的y轴截距仅发生1%的变化，就会导致内毒素测定值发生30%至35%的变化。因此，已知10EU/mL的样品可能读数为13.5EU/mL，这并不是因为样品中的内毒素含量发生了变化，而是因为y-截距发生了变化。控制浊度法鲎试剂检测变异性的一个重要方法是密切关注起始（反应）时间。这些起始时间看似微小的变化都会导致线性、斜率和y轴截距的变化，从而对检测结果产生重大影响^[6]。

三、评估差异

虽然可以采取措施减少变异，但根据良好质量控制的原则，实验室应该有监督和评估的手段，以确定检测结果是否令人满意，以及变异是否过大到足以引起关注的程度。其中一种方法就是审查变异系数（CV）。

（一）变异系数的应用

变异系数是精确度的衡量标准。分析程序的精确度是指单个检测结果之间的一致程度（或者，用检测术语来说，是指当分析程序重复应用于单一、同体积生物基质的多个等分试样时，单个分析物测量结果的接近程度）^[7]。变异系数是以平均值的百分比表示的标准差。当不同样本之间的平均值增加时，变异系数值就可以用来测量变异性。

通常，变异系数表示为测试重复之间的百分比（%CV）。这可以应用于标准曲线点和测试样品复制。对于鲎试剂，常见的要求是CV≤10%或≤25%（取决于裂解物供应商设定的要求）。百分比变异系数越低，说明不同测试副本之间的精确度越接近（与平均值的“散差”相对较小）。

计算CV有不同的方法。这些方法与计算标准差的不同方法有关。一旦采用了标准差的计算方法，CV就可以表示为标准差与平均值之间的比率。

由此，可以计算出%CV值：

100% ×（标准差/算术平均数）

从上式可以看出，CV转换为百分比的方法是将得到的数字乘以100，得出%CV值^[8]。

在评估鲎试剂检测时，根据EU/mL的测量值计算出的%CV值通常会随着内毒素浓度的降低而增加，因为较高浓度的内毒素通常可获得<10%的值，而较低浓度的内毒素（通常接近标准曲线的末端并接近检测限）可获得10%到30%的值。

在此需要指出的是，不同的鲎试剂供应商对鲎试剂检测有不同的验收标准，并通过软件包以不同的方式计算其%CV值。例如，有些供应商根据以每毫升内毒素单位（EU/ mL）表示的结果来计算变异系数；而有些供应商则根据样品的起始时间（以毫吸光为单位）来计算变异系数^[9,10]。

（二）检测稀释错误

除变异系数外，稀释误差也需要评估。为了检查鲎试剂检测是否正确，应检查标准曲线上内毒素浓度最高点的反应时间，确保其在以秒为单位的预期时间范围内。这一点非常重要，因为这些起始时间看似微小的变化会导致线性度、斜率和Y-截距的变化，从而对测试结果产生重大影响^[11]。

为此，需要检查起始内毒素浓度的起始时间（如5.0 EU/ml）。这需要对历史数据进行研究，以确定典型范围。为了提高准确性，建议对使用内毒素进行的前100次测试进行评估。如果稀释液的制备出现错误，那么起始时间将超出预期范围。

检测起始时间是检测误差的一个重要指标，因为它直接关系到光度法LAL检测方法的工作方式。采用动态浊度法或显色法进行LAL检测时，裂解液（等分到反应管中）会与等分样品或标准曲线稀释液中的任何内毒素发生反应^[12]。所发生的反应是根据时间测量浊度或颜色的变化。达到浊度阈值（在预先设定的光学范围内以毫吸光度单位测量）的时间越快，内毒素浓度就越高。这一起始时间范围不仅因内毒素水平而异，而且不同批次的裂解液和对照标准内毒素也会有所不同。

起始时间必须在正确的范围内，因为它可以确定已进行了正确的稀释。举例来说，如果测试的稀释方法不正确，相关系数和报告的内毒素值看起来仍然是正确的。这是因为相关系数是实际值与预期值之间的最佳拟合线，而软件会解释这些数据，并通过从标准系列中推断出估计的内毒素浓度^[13]。

根据平均值的第二个标准偏差，可以计算出起始浓度的光密度达到所需阈值所需的时间范围。 鉴于LAL检验本身存在误差（通常认为误差为±25%），为了与其他生物检验方法保持一定程度的标准化，第二个标准差可以说是最合适的测量方法。标准差是衡量单个元素偏离平均值（均值）的程度。其计算公式为方差的平方根（如图1所示）。

使用平均值的2个标准差表明95%的值落在上下限范围内。除此之外的5%代表非典型值。

每次LAL检验完成后，记录最高内毒素浓度（曲线起点）的起始时间都要与这一范围进行比较，只有当测得的起始时间在这一范围内时，才可认为检验是合格的。如果出现稀释错误，那么起始时间就会超出预期的时间范围。

通过采用平均值的2个标准差，任何超出计算范围的测试值都被视为非典型值，不能代表正常人群。因此，需要对LAL测试进行调查。作为进一步检查技术员工作表现的一种方法，区域主管可对每位技术员标准曲线的起始时间进行趋势分析和检查。

（三）标准曲线相关系数

还可以对标准系列的线性度进行额外的检查。为此，应检查每次测试的标准曲线的相关系数（要求相关系数大于或等于0.980）。药典要求每次测试都要进行这项检查。

标准曲线的一致性是LAL检验的一个重要特点。线性标准曲线的Y-截距只要变化1%，就会导致内毒素测定结果变化30%至35%。因此，已知为10EU/mL的样品，读数可能为13.5EU/mL——这不是因为样品中的内毒素含量发生了变化，而是因为y-截距发生了变化^[6]。

（四）阴性对照

每次检测都应进行阴性对照。阴性对照是用于构建标准曲线的水样。阴性对照样品可显示在制备内毒素系列时是否发生了污染。对照组的内毒素含量必须低于标准曲线中的最低内毒素浓度（常规标准系列为0.05EU/mL）。这项检查是药典要求的。

四、总结

本文探讨了影响 LAL 检测的一些变化来源。对于实验室用户来说，了解这些因素非常重要，尤其是在设计检测方法和调查检测异常时。文章还考虑了一个衡量变异性的关键指标：变异系数。这是实验室主管在审查测试结果时需要进行的一项重要检查。

参考文献

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12、Guy D. “Endotoxins and Depyrogenation” in Hodges N. and Hanlon G. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Euromed, 2003:12.1–12.15.

13、McCullough K. ‘Back to Basics: Where Did My Standard Curve Come From?’, LAL User Group Newsletter. 2009:3(2):6-8.